و اهمیت پژوهش…. 23
1.13 اهداف پژوهش…. 24
1.13.1 هدف اصلی.. 24
1.13.2 اهداف ویژه 24
1.13.3 هدف کاربردی.. 25
فصل 2: بررسی متون.. 26
2.1 بررسی متون مرتبط با موضوع. 27
فصل 3:مواد و روش ها 32
3.1 مواد شیمیایی و آنزیم ها 33
3.1.1 پلاسمیدوسویه باکتری.. 35
3.1.1.1 خصوصیات پلاسمید.. 36
3.1.1.2 خصوصیات میزبان.. 37
3.2 روش ها 37
3.2.1 کشت باکتری.. 37
3.2.1.1 مواد و وسایل مورد نیاز برای کشت باکتری… 37
3.2.1.2 طرز تهیه محیط کشت LB مایع.. 38
3.2.1.3 گلیسرول استاک…. 38
3.2.2 روش انجام miniprepاستخراج DNA پلاسمیدی از باکتری.. 39
3.2.2.1 بررسی کمی وکیفی DNA پلاسمیدی… 41
3.2.3 هضم آنزیمی پلاسمید های استخراج شده 45
3.2.4 کشت سلولی.. 46
3.2.4.1 محیط کشت…. 46
3.2.4.2 سرم جنینی گاوFBS.. 47
3.2.4.3 تهیه محیط انجاد از سلولها 47
3.2.4.4 خصوصیات سلولهای مورد استفاده شده در این پایان نامه. 48
3.2.5 تعیین منحنی کشندگی انتی بیوتیک G418. 48
3.2.6 منطبق سازی سلولها 48
3.2.7 ترانسفکشن سلولهای Y79 با وکتور پلاسمیدی نوترکیب pEGFP-TGIF2LX.. 49
3.2.8 انتخاب سلولهای مثبت… 50
3.2.9 بررسی بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده در سطح mRNA بوسیله Realtime RT-PCR 51
3.2.9.1 محافظت از RNA… 52
3.2.9.2 استخراج RNA… 55
3.2.9.3 تیمار نمونه RNA باآنزیم دئوکسی ریبونوکلئاز I. 59
3.2.9.4 سنتز DNA مکمل(cDNA) 60
3.2.9.5 PCR(Polymerase chain reaction) واکنش زنجیره ای پلیمراز. 64
3.2.9.6 واکنش Realtime PCR… 68
3.2.9.7 تجزیه و تحلیل داده های حاصل از واکنش Realtime RT-PCR… 77
3.2.10 بررسی بیان eGFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western blot 78
3.2.10.1 الکتروفورز عمودی SDS-PAGE.. 78
3.2.10.2 رنگ آمیزی SDS-PAGE.. 84
3.2.10.3 وسترن بلاتینگ….. 86
3.2.11 بررسی میزان تکثیر سلولی بوسیله تجزیه نمک تترازولیوم. 90
3.2.11.1 بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل.. 90
3.2.11.2 بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل.. 91
3.2.11.3 پروتکل شمارش سلول.. 92
3.2.12 مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX, miRNA Let7g,18a,34a,22,20 در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل به وسیله Real time RT-PCR.. 92
فصل 4: نتایج و یافته ها 96
4.1Mini prep و هضم DNA پلاسمیدی جهت تایید وکتور نوترکیب… 97
4.2 بررسی بیانTGIF2LX در سطح mRNA… 98
4.2.1 نتیجه بررسی کیفی و کمی RNA.. 98
4.2.2 بررسی کیفی cDNA.. 99
4.3 بررسی بیان TGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده 101
4.3.1 مطالعه بیان TGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل بوسیله میکروسکوپ 101
4.3.2 تایید بیان واضح ژن GFP-TGIF2LX توسط Realtime RT- PCR.. 102
4.3.3 مطالعه بیان ژن TGIF2LX در سلول های ترانسفکت شده با وکتور حاوی GFP-TGIF2LX در سطح پروتئین بوسیله Western Blot 104
4.3.4 مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیانTGIF2LX در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل 105
4.4 بررسی اثر بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79. 105
4.4.1 نتایج ازمایش (MTT)Microculturetetrazolium Test 105
4.4.2 بررسی اثر متقابل SD-208 و بیان افزایشی TGIF2LX بر روی سلولهای Y79 در مقایسه با کنترل.. 106
4.5 بررسی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20a در سلولهای ترانسفکت شده و کنترل.. 108
4.6 مطالعه بیان اثر داروی SD-208 بر روی بیان miRNA Let7g,18a,34a.22,20 در سلولهای ترانسفکت شده Y79 در مقایسه با نمونه های کنترل.. 109
4.7 Ct در واکنش Realtime PCR.. 110
فصل 5: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادها 113
5.1 بحث 114
5.2 تاثیر بیان افزایشی TGIF2lX بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79. 116
5.3 تاثیر دارویSD-208 بر روی Cellular Viability در رده سلولی Y79 بیان کننده افزایشی TGIF2LX و کنترل 117
5.4 اثر SD-208 بر روی بیان TGIF2LX در رده سلولی Y79 ترانسفکت شده در مقایسه با کنترل 118
5.5 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیانmiRNA های مورد مطالعه. 118
5.5.1 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNAlet7g در رده سلولی Y79. 118
5.5.2 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA18a در رده سلولی Y79. 119
5.5.3 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA34a در رده سلولی Y79. 119
5.5.4 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA22 در رده سلولی.. 119
5.5.5 اثر متقابل SD-208 و TGIF2LX بر روی بیان miRNA20a در رده سلولی Y79. 120
5.6 نتیجه گیری.. 120
7.5 پیشنهاد ها ……………………….121
منابع و مراجع.. 122
پیوست ها 131
1.1 رتینوبلاستوما
رتینوبلاستوما یکی از سرطان های بدخیم چشمی شایع کودکی میباشد که به دو فرم پراکنده (تک گیر) و ارثی(خانوادگی) وجود دارد [1]. تقریبا 4 درصد تومورهای کودکان را رتینو بلاستوما تشکیل میدهد .این تومور شایعترین بدخیمی اولیه چشمی است که در غرب 99درصد کودکان از این سرطان نجات پیدا میکنند ولی بیش از 90 درصدآنها بینایی خود را از دست میدهند و متاسفانه در کشورهای در حال توسعه بقا کودک تقریبا 50 درصد میباشد[2] و [3].
اغلب کودکان مبتلا به رتینوبلاستوما با علامت لوکوکوریا[1] (شکل 1‑1) که والدین آنها متوجه مشوند مراجعه میکنند[4].
| 1.1.1 اپیدمیولوژی |
رتینوبلاستوما تقریبا با شیوع 1 در 15000و 1 در 16600تولد زنده در امریکا و اروپای شمالی رخ میدهد [5] و [6] ودر بین سالهای 2005-2009شیوع سالیانه رتینوبلاستوما در امریکا 4.1 در هرمیلیون کودک زیر 15 سال میباشد[5] ودر کل دنیا سالیانه 5000تا 8000 کودک مبتلا به رتینوبلاستوما میشوند [7] به طور متوسط سن تشخیص بیماری زیر 2 سال است و تقریبا 95درصد قبل از 5 سالگی میباشد.شیوع بیماری در بین دختر وپسر و سیاه و سفید شبیه به هم میباشد[5].
تقریبا 1/4 موارد رتینوبلاستوما دو طرفه میباشد بیماریهای دوطرفه همیشه الگوی ارثی دارند. تومور های دو طرفه زودتر در کودکان رخ میدهد که نشان دهنده وجود موتاسیون در سلولهای زایا میباشد. فرم ارثی رتینوبلاستوما نیازمند یک جهش ژرم لاین است که میتواند از هر یک از والدین یا از محیط( که منجر به یک موتاسیون ژرم لاین شود) میباشد. بر عکس فقط 15 درصد از موارد یکطرفه ارثی هستند که اغلب چند کانونی هستند و باید از نظر جهش ژرم لاین بررسی شوند که معمولا در 2سال اول زندگی رخ میدهد کم تر از 10 درصد بیماران رتینوبلاستومایی تاریخچه مثبت خانوادگی دارند.
تقریبا 60 درصد کودکان با رتینوبلاستوما الگوی یک طرفه غیر ارثی دارند.کودکان با رتینوبلاستوما غیرارثی یک موتاسیون جدید در یک سلول شبکیه دارند که منجر به تومور میشوند [8] . ناهنجاری ژنتیک در فرم ارثی رتینوبلاستوما موجب ایجاد و پیشرفت تومور مثل استئوژنیک سارکوما وسارکومای بافت نرم(بخصوص لیومیوسارکوما)و ملانومای بدخیم میشود شیوع سرطان ثانویه بعد از تشخیص رتینوبلاستوما در فرم ارثی و غیرارثی به ترتیب 51 و 5 درصد میباشد که بیش از 60 درصد سرطان ها سارکوما میباشد [9].
1.1.2 پاتوژنز
رتینوبلاستوما معمولا بوسیله غیر فعال شدن هر دو الل ژن رتینوبلاستوما رخ میدهد.با الگوی اتوزومی غالب این ژن در ناحیه کروموزم 13 بازوی بلند در ناحیه 14قرار دارد که کد کننده یک پروتئین هسته ای با نقش تومورساپرسوری میباشد [10].
مدل 2 ضربه ای که پیشنهاد شده است دلیل متفاوت بودن ویژگی های کلینیکی موارد ارثی و غیر ارثی رتینوبلاستوما را مطرح میکند[11]. (شکل 1‑2)
| شکل 1‑2: مدل 2 ضربه ای رتینوبلاستوما |
در مدل ارثی در ژن RB1 یک موتاسیون در کل سلول ها وجود دارد و ضربه دوم در مراحل بعدی تکامل رخ میدهد که این افراد مستعد رتینوبلاستومای دوطرفه و چندکانونی میباشند.ضربه دوم میتواند رخ دهد ویا توسط تغییرات اپیژنتیک خاموش شود.
در مدل رتینوبلاستومای غیر ارثی دو جهش در یک الل به صورت خودبه خودی در یک سلول سوماتیک شبکیه رخ میدهد که معمولا منجر به مدل کلینیکی تومور یه کانونی ویه طرفه رتینوبلاستوما میشود [12].
رتینوبلاستوما اگر درمان نشود رشد میکند و جای چشم را اشغال میکند وکره چشم را از بین میبرد و ممکن است طی 4 ماه بعد از تشخیص به مغز متاستاز بدهد و مرگ طی یک سال رخ بدهد.اغلب راههای متاستاز تومور به وسیله اپتیک نرو[3] به سیستم عصب مرکزی و یا گسترش از طریق مشیمیه به اربیت میباشد [13].
1.1.3 ویژگی های کلینیکی وتشخیصی
لوکوکوریا شایعترین علامت در کودکان رتینوبلاستومایی میباشد اگر چه علایم دیگر نیز وجود دارد و لوکوکوریا برای تشخیص ضروری نیست. شایعترین علایم لوکوکوریا (54درصد) و استرابیسم (19درصد) کاهش دید (4درصد) عفونت چشمی (5درصد) و تاریخچه خانوادگی مثبت (5درصد) میباشد و موارد دیگر عنبیه هتروکروم وخونریزی ویتره و هایفما بدون ضربه و گلوکوم و سلولیت اربیت و پروپتوزیس و درد چشم و تب میباشد [14].
1.2 تاریخچه خانوادگی
میزان خطر در میان نسل فرد بستگی به تاریخچه خانوادگی رتینوبلاستوما ویا چگونگی تومور در فرد نشانه دارد(به طور مثال یه طرفه یا دو طرفه یه کانونه یا دو کانونه).میزان خطر از 6 درصد (اگر پروباند بیماری یه طرفه و یه کانونه داشته باشد یا با تاریخچه خانوادگی منفی باشد)تا 50 درصد میباشد(اگر پروباند دارای موتاسیون ژرم لاین باشد یا حدس زده شود که موتاسیون دارد)[15].
کودک با ریسک بالا ی رتینوبلاستوما باید سریع بعد از به دنیا آمدن توسط چشم پزشک ارزیابی شود. غربالگری باید هر 3-4ماه تا 3-4 سالگی وهر6 ماه تا 5-6 سالگی صورت گیرد [16].
1.3 تشخیص
تشخیص رتینوبلاستوما از طریق مردمک دیلاته شده وبا دستگاه افتالموسکوپی ایندایرکت تحت بیهوشی صورت میگیرد.یافته ها به صورت توده شبکیه گچی خاکستری رنگ و تردشونده یافت میشود. پاتولوژی برای ثابت کردن تشخیص لازم میباشد.تست های کمکی اگرچه همیشه ضروری نمیباشندولی ممکن است برای ثابت کردن تشخیص انجام شود.سونوگرافی چشمی یا مغز نگاری کامپوتری سی تی اسکن یک توموده ی جامد با ویژگی های کلسیفیکاسیون را نشان دهد. تصویر رزونانس مغناطیسی[4] نیز میتواند وجود توده داخل چشمی را ثابت کند بویژه در مواردی که تشخیص بیماری با بیماری کت سخت میباشد.یافته های فوندوسکوپی میتواند رتینوبلاستوما را از بیماری کت و از بیماری پارگی رتین اگزوداتیو متمایز کند ولی کلسیفیکاسیون را که عامل مهم در تشخیص سایز تومور و درگیری عصب چشمی و وجود آسیب درون جمجمه ای میباشد را نمیتواند نشان دهد [14].
1.4 ارزیابی قبل از درمان
تست های غیر ژنتیکی: ارزیابی کودکان با رتینوبلاستوما کاملا منحصر به فرد جهت انتخاب مدل درمانی میباشد(مثلاتعداد پایه ای سلولها وبیوشیمی خون جهت شروع شیمی درمانی).برای بیماران با تومور های کوچک (به جز در موارد خانوادگی)بررسی کامل و معاینه زیر بیهوشی و اولتراسونوگرافی و MRIسر و چشم معمولا کفایت میکند[17]. در مراحل اولیه تشخیص وجود موارد متاستاز نادر میباشد(ازمایش مغز استخوان و آب نخاع و اسکن استخوان)ومعمولا این موارد ازمایش نمیشود [18]. اما اگر مدارکی دال بر وجود تومور در بیرون از کره چشم وجود دارد(تهاجم به عصب چشم یا درگیری مشیمیه) ارزیابی های کامل متاستاز باید انجام شود.علایم ونشانه های متاستاز شامل بی اشتهایی یا کاهش وزن وتهوع و سر درد و آسیب عصبی ووجود توده اربیت یا توده نرم بافتی میباشد[19].
تست های ژنتیک مولکولی: برای همه بیماران تستهای ژنتیکی پیشنهاد میشود. بیماران با موتاسیون ژرم لاین باید به متخصص ژنتیک ارجاع داده شوندتا والدین و فرزندان تست شوند .تست مولکولی گلبول های سفید خون محیطی در 90-95 درصد موارد موتاسیون های ژرم لاین را تشخیص میدهد در موارد یه طرفه تست مولکولی باید روی سلول تومور صورت بگیرد تا موتاسیون خاصRB1 تشخیص داده شود [20].
1.5 درمان
گزینه های گوناگونی برای درمان کودکان با رتینوبلاستوما در دسترس میباشد.انتخاب درمان وابسته به پیش آگهی بینایی وسایز و مکان تومور حضور یا عدم حضور توده در ویتره یا ساب رتینال و سن بیمار دارد.
تخلیه چشم : معمولا برای تومورهای بزرگ که بیش از 50درصد کره چشم را اشغال کرده است و چشم دردناک ونابینا و گسترش تومور به عصب چشم صورت گرفته است انجام میگیرد که کودک تحت بیهوشی عمومی قرار گرفته و چشم با ماهیچه های اطراف آن برداشته میشود .بعد از انوکلئویشن باید شیمی درمانی یا براکیوتراپی در بیماران برای جلوگیری از متاستاز لحاظ شود[21] و [22]).
هیدرکسی اپاتیت که بعد از تخلیه چشم برای ساخته شدن عروق به کار میرود و پروتز بعد از سه ماه که بیمار بهبود پیدا میکند توسط چشم پزشک جاگذاری میشود.کودکان بعد از تخلیه چشم باید از لحاظ عود مجدد تا 2 سال بعد جراحی پیگیری گردد. در مطالعه 1674 بیمار تحت جراحی از سال1914تا 2006 مورد بررسی قرار گرفتند. شیوع عود مجدد تومور در 24 ماه بررسی شد که عود97درصدی بیماران در 24 ماه اول بودند وبیماران 85 درصد با عود اربیت متاستازثانویه داشتند. که75 درصد بیماران با عود اربیت به علت متاستاز فوت کردند [23].
رادیوتراپی خارجی: سلول های سرطانی به علت رشد سریعی که دارند اگر در معرض اشعه قرار بگیرند از بین میروند.یکی از راههای درمانی رتینوبلاستوما به خصوص در تومورهای دوطرفه بزرگ یا گسترش داده شده به ویتره یا تومور بزرگ نزدیک عصب بینایی یا مرکز دید فووآ یا همچنین برای تومورهای بزرگی که نمیتوان با کرایو تراپی فتوکواگولیشن درمان کرد میباشد و از موارد راههای درمانی میباشد که در حال حاضر به ندرت استفاده میشود [24].
فرم در حال بارگذاری ...
