: بور ریز مغذی ضروری برای گیاهان است و مطالعات نشان داده که این عنصر می تواند به عنوان یک ریزمغذی برای حیوانات و انسان نیز محسوب شود. در این پژوهش به منظور درک بهتر از نقش بور، اثر دوزهای مختلف اسید بوریک بر توانایی حیات، تکثیر، تمایز و فاکتورهای بیوشیمیائی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت (MSCs) مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روشها: MSCs تا سه پاساژ کشت و برای بررسی توان تکثیر و تمایز در محیطهای کشت فاقد ترکیبات استئوژنیک و واجد ترکیبات استئوژنیک آلوده به اسید بوریک قرار داده شد. در بخش اول که شامل بررسی توانائی تکثیر میشود، توانایی حیات با کمک تست MTT و تریپان بلو در زمانهای 12، 24و 36 ساعت بررسی و دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک و زمان 36 ساعت جهت انجام مطالعه انتخاب گردید. در ادامه، توانائی تکثیر با استفاده از توانایی تشکیل کلونی (CFA) و دو برابرشدگی جمعیتی (PDN)، مورفولوژی سلول ها توسط رنگ آمیزی فلوروسنس، سطح الکترولیتهای سدیم، پتاسیم با استفاده از فلیم فتومتر و میزان کلسیم، میزان فعالیت آنزیمهای LDH، ALP ،AST و ALT توسط کیتهای تجاری ارزیابی شد. در بخش دوم که شامل بررسی توانائی تمایز میشود، تاثیر دوز 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر به عنوان دوزهای منتخب در زمانهای 5، 10، 15 و 21 روز بر توانایی زیستی، مورفولوژی، سطح الکترولیتها و فعالیت آنزیم هایLDH ،AST و ALT در سلول ها تمایز یافته بررسی شد. میزان تمایز با استفاده از روش کمی آلیزارین رد، غلظت کلسیم و فعالیت آنزیم ALP مورد ارزیابی قرار گرفته و داده ها توسط روش آماری ANOVA، آزمون tukey آنالیز و p<0/05 به عنوان سطح معنی دار در نظر گرفته شد. نتایج: نتایج بدست آمده نشان داد که در سلول های مزانشیم میزان توانایی زیستی در دوز و زمان کم تغییر نمی کند، اما افزایش در هر دو فاکتور زمان و دوز، کاهش فعالیت آنزیمهای متابولیکی و متعاقبا حیات را بدنبال داشت. در سلولهای استئوژنیک فقط در دوز بالا و با گذشت زمان منجر به کاهش توانایی حیات سلولی شد و دوز 6 نانوگرم هیچ اثری بر روی توانایی حیات نشان نداد ضمنا فاکتورهای تمایزی، الکترولیتها و آنزیمهای متابولیکی با افزایش زمان فقط در دوز 6 نانوگرم افزایش یافت. نتیجه گیری: تاثیر اسید بوریک به نوع سلول و شرایط تیمار وابسته است به گونه ای که در این مطالعه نشان داده شد که حساسیت سلولهای مزانشیم نسبت به سلولهای استئوبلاست بیشتر است. علاوه بر این دوز پایین اسیدبوریک دارای تاثیر مثبتی بر روند تمایز استخوان بود، لذا دوزهای پایین اسید بوریک می تواند نقش مفیدی بر سلامت سلول های مزانشیم و تمایز آنها به استئوبلاست داشته باشد.
کلید واژهها: سلول های بنیادی مزانشیم مغز استخوان، اسید بوریک، قابلیت حیات، آنزیمهای متابولیکی، تمایز
| فصل اول: کلیات و هدف | |
| 1 | 1-1 سلولهای بنیادی ……………………………………………………………………… |
| 1 | 1-1- 1 تعریف سلولهای بنیادی………………………………………….. |
| 2 | 1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی……………………. |
| 3 | 1-1-3 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ………………………………………………………. |
| 4 | 1-1-4 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس منشا …………………………………………………….. |
| 4 | 1-1-4-1 سلولهای بنیادی جنینی………………………………………………… |
| 6 | 1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف……………………………………….. |
| 7 | 1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان……………………….. |
| 10 | 1-1-5 سلولهای مغز استخوان ………………………………. |
| 10 | 1-1-5-1 سلولهای بنیادی خونساز………………………….. |
| 11 | 1-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان…………………………….. |
| 12 | 1-2 تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ……………………………….. |
| 13 | 1-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم ………………………….. |
| 14 | 1-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان …………………………………….. |
| 15 | 1-2-3 ویژگیهای اساسی سلول بنیادی مزانشیم ……………………. |
| 16 | 1-3 کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ……………….. |
| 17 | 1-3-1 ترمیم استخوان ………………………………………………. |
| 17 | 1-4 بافت استخوان …………………………………………….. |
| 20 | 1-5 استئوژنز(استخوانسازی) …………………………….. |
| 21 | 1-5-1 استخوانسازی اولیه یا جنینی ……………………….. |
| 23 | 1-5-2 استخوانسازی ثانویه ……………………………………………….. |
| 23 | 1-5-3 دوبارهسازی استخوان ………………………………………….. |
| 24 | 1-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی …………….. |
| 25 | 1-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ……………………………………………… |
| 25 | 1-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلولهای بنیادی مزانشیمی …………………………………………….. |
| 27 | 1-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان ………………………… |
| 29 | 1-7 عنصر بور …………………………………….. |
| 30 | 1-7-1 مشتقات بور ……………………………………………………….. |
| 32 | 1-7-2 فراوانی عنصر بور ……………………………………… |
| 32 | 1-7-3 تاریخچه مصرف بور ……………………………….. |
| 33 | 1-7-4 منابع طبیعی بور………………………………… |
| 34 | 1-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران …………………………………………. |
| 34 | 1-7-5-1 تاثیر بور بر فیزیولوژی بدن ………………………………….. |
| 36 | 1-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها …………………………………………………….. |
| 37 | 1-7-6 کاربرد بور در دارو ……………………………………………… |
| 37 | 1-7-7 سرطان ………………………………………………………. |
| 39 | 1-8 اثرات بور روی استخوان ……………………………………. |
| 40 | 1-9 بور و خون ……………………………………………………….. |
| 41 | 1-10 بور در گیاهان ………………………………………………………… |
| 42 | 1-11 سمیت بور ……………………………………………. |
| 44 | 1-12 محدوده استفاده بور ……………………………………………… |
| 45 | مروری بر مطالعات گذشته ……………………………………… |
| 47 | هدف مطالعه …………………………………………………………….. |
| فصل دوم: مواد و روشها | |
| 50 | 2-1 انتخاب رت ………………………………………………………………. |
| 50 | 2-2 جدا سازی وتكثیر سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان ………………………………….. |
| 52 | 2-2-1 اجرای پاساژ ……………………………… |
| 54 | 2-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ………………………………………. |
| 54 | 2-3-1 تمایز به استخوان ……………………………………………………………. |
| 55 | 2-4 بررسی توان زیستی سلولها (دوز فایندینگ) ……………………………… |
| 55 | 2-4-1 رنگ آمیزی تریپان بلو ……………………………………………….. |
| 57 | 2-4-2 سنجش تترازولیوم (MTT) ……………………………………………………. |
| 57 | 2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT)غیر استئوژنیک( ………………………………………………………………….. |
| 58 | 2-4-2-2 ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم ………………………………………………… |
| 59 | 2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک ……………………. |
| 60 | 2-5 انتخاب دوز مورد نظر ……………………………………….. |
| 60 | 2-6 بررسی توان تکثیری سلولهای بنیادی مزانشیم ……………. |
| 61 | 2-6-1 سنجش توانایی کلونیزایی ……………………………… |
| 63 | 2-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ……………….. |
| 62 | 2-7 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آمیزی فلوروسنت …………………………………………….. |
| 65 | 2-8 آزمونهای بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی …………………………………………. |
| 65 | 2-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی ……………………………… |
| 65 | 2-8-2 بررسی فعالیت آنزیمها ……………………………………… |
| 66 | 2-8-2-1 تهیه ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری ……………………………………. |
| 66 | 2-8-2-2 ترانس آمینازها ………………………………… |
| 68 | 2-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز………………………………… |
| 70 | 2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ……………………………………………… |
| 72 | 2-8-3 سنجش میزان رسوب ماتریكس معدنی به كمك رنگ آلیزارین رد در سلول های استئوژنیک |
| 72 | 2-8-3-1 رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد ……………………….. |
| 73 | 2-8-3-2 بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده ………………………………… |
| 73 | 2-8-4 بررسی الکترولیت ها )کلسیم، سدیم و پتاسیم( ……………………. |
| 73 | 2-8-4-1 بررسی میزان کلسیم داخل سلولی با استفاده از کیت کلسیم به روش رنگ سنجی ………… |
| 74 | 2-8-4-1-1 مراحل انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته )استئوبلاست( ………………………….. |
| 75 | 2-8-4-1-2 مراحل انجام اندازهگیری میزان کلسیم ….. |
| 76 | 2-8-4-2 اندازهگیری غلظت سدیم و پتاسیم سلول استئوژنیک و غیر استئوژنیک ………………………….. |
| 81 | 2-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها ………….. |
| فصل سوم: نتایج | |
| 82 | 3-1 الف: نتایج مرحله اول ………………………………… |
| 82 | 3-1-1 رشد و تکثیر سلولهای بنیادی مزانشیم …………………… |
| 82 | 3-1-2 اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت …………………… |
| 85 | 3-1-3 بررسی مورفولوژی سلولهای تیمار شده ……………… |
| 87 | 3-1-4 نتایج توانایی کلونی زایی، تعداد دوبرابر شدگی جمعیت سلول …………………………………………….. |
| 89 | 3-1-5 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی …… |
| 91 | 3-1-6 میزان الکترولیتها………………………………………….. |
| 92 | 3-2 نتایج اثر دوزهای انتخابی اسید بوریک بر شاخص های تمایز به استئوبلاست ………………………….. |
| 92 | 3-2-1 توانایی زیستی سلولها در روند تمایز ……………………….. |
| 93 | 3-2-2 بررسی تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگآمیزی فلورسنت در نمونههای استئوژنیک |
| 96 | 3-2-3 بررسی اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی سلولهای تمایز یافته ……………………………….. |
| 97 | 3-2-3-1 میزان معدنی شدن ماتریکس با سنجش رنگ آلیزارین رد ……………………………………………….. |
| 100 | 3-2-3-2 میزان رسوب کلسیم …………………………………….. |
| 101 | 3-2-3-3 بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز …………. |
| 101 | 3-2-3-2 بررسی فعالیت آنزیم آسپارتات و آلانین ترانس آمیناز ……………………………………………………….. |
| 103 | 3-2-3-5 بررسی فعالیت لاکتات دهیدروژناز ……………….. |
| 103 | 3-2-3-6 بررسی سطح الکترولیت های سلولهای استئوژنیک …………………………………………… |
|
|
| فصل چهارم: بحث و نتیجهگیری | |
| 105 | 4-3 اثر اسیدبوریک بر سلولهای مزانشیم ……………………….. |
| 105 | 4-1-1اثر اسید بوریک بر توانایی زیستی و توان تکثیر سلولها …………………………………………………… |
| 108 | 4-1-2 بررسی تاثیر اسید بوریک بر تغییرات مورفولوژیکی ………………………………………………………………… |
| 109 | 4-1-3 اثر اسید بوریک بر فاکتورهای بیوشیمیایی …. |
| 113 | 4-1-4 اثر اسید بوریک بر فعالیت آنزیمهای متابولیکی ……………………………………… |
| 116 | 4-2 اثر اسیدبوریک بر تمایز سلولی ……………………………… |
| 116 | 4-2-1 توانایی زیستی ……………………………………. |
| 119 | 4-2-2 بررسی سطح الکترولیت ها ……………………………………………. |
| 120 | 4-2-3 بررسی فاکتورهای استئوژنیک ……………………. |
| 124 | 4-2-4 بررسی اثر اسید بوریک بر آنزیم های متابولیکی ………….. |
| 127 | 4-2-5 تاثیر اسید بوریک بر مورفولوژی سلولهای تمایزی …………………………………………….. |
| 128 | 4-3 نتیجه گیری ……………………………………………………… |
| 129 | 4-4 پیشنهادات ……………………………………………………………. |
| فصل پنجم:ضمیمه | |
| 131 | 5-1 روش تهیه محیط کشت …………………………………………………. |
| 131 | 5-2 تهیه ی فسفات بافر سالین PBS– ……………………………. |
| 132 | 5-3 تهیه ی فسفات بافر سالین مثبت PBS+……………………… |
| 132 | 5-4 روش تهیه محیط تمایزی استئوژنیک ………………………….. |
| 133 | 5-5 آماده سازی آلیزارین رد …………………………………………… |
| 133 | 5-6 روش تهیه محلول تریپانبلو 4/0 درصد ……………………………. |
| 133 | 5-7 تهیه کریستال ویولت ……………………………………… |
| 133 | 5-8 روش تهیه محلول MTT…………………………………. |
| 133 | 5-9 روش تهیه بافر شست و شو( ( Tris-Hcl-NaCl………………….. |
| 133 | 5-10 مواد لازم و روش تهیه بافر استخراج ( Tris-Hcl) ………… |
| 134 | 5-11 روش تهیه بافر ARS ………………. |
| 134 | 5-12 روش تهیه محلول BSA …………………………… |
| 134 | 5-13 روش تهیه محلول کمپلکس لاوری ………… |
| 135 | 5-14 روش تهیه بافر استخراج کلسیم …………………………. |
| 135 | 5-15 روش تهیه رنگ های فلورسنس هوخست و آکریدین اورنژ …. |
تعریف سلولهای بنیادی
به طور نرمال سلولهای تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی میمانند، اما در بدن سلولهای دیگری به نام سلولهای بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلولهای دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ……. را دارا میباشند (1).
سلولهای بنیادی[1] سلولهایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلولهای تخصصیافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلولها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلولهایی با خواص یکسان (خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلولهای تمایزیافته میباشند (شکل 1-1)(1).
به دلیل اینکه این سلولها منشا تولید بقیه انواع سلولها هستند واژه بنیادی در مورد آنها به کار میرود به عبارت دیگر یک سلول بنیادی، سلولی است که به دلیل توانایی کسب کلیه اعمال تخصصی قابلیت تبدیل به سلولهای تخصص یافته را دارد. این سلولها جهت تمایز نیازمند دریافت سیگنال هستند. قاعدتاً یک سلول بنیادی تا قبل از دریافت یک سیگنال جهت تکامل به سلول تخصصی به صورت غیرتخصصی باقی میماند. سلولهای بنیادی در بدن انسان ویژگی تمایز به بسیاری از سلولها را دارند. همچنین به عنوان سیستم ترمیم به خدمت گرفته میشوند زیرا که توانایی تقسیم بدون محدودیت برای جایگزینی دیگر سلولها را دارا میباشند. وقتی یک سلول بنیادی تقسیم میشود هر سلول جدید بدست آمده این پتانسیل را دارد که سلول بنیادی باقی بماند یا به سلول تخصصی جدید مثل سلولهای خونی و … تمایز یابد (1).
| شکل1-1: توانائی خودنوزائی و پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی (www.cellingbiosciences.com) |
1-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی
تکثیر یا خودتجدیدی، توانایی سلولها در تولید نسخههای یکسان از خود، توسط تقسیم میتوز در یک دوره زمانی مشخص است به صورتی که خصوصیات ژنتیکی و کاریوتایپی در سلولهای دختری عینا شبیه سلولهای مادری باقی میماند.
خودتجدیدی سلولها بنیادی تحت تاثیر سیگنالهای درونی سلول بنیادی که به صورت تقسیم متقارن و نامتقارن است، قرار دارد. علاوه بر این سیگنالهای درونی، خودتجدیدی سلولهای بنیادی تحت تاثیر عوامل محیطی چون آسیب یا صدمه نیز میباشد و تحت تاثیر این شرایط یک سلول بنیادی ممکن است دو سلول دختری ایجاد کند که یا به صورت سلولهای بنیادی باقی میمانند یا متمایز میشوند (2).
1-1-3 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها:
سلول های بنیادی بر اساس توان تمایزی به صورت زیر دسته بندی می شوند:
الف) همه توان[4]: واژه Totipotent از دو قسمت Toti= همه، potent= توانایی تشکیل شده است. از جمله این سلولها میتوان بلاستومرهای یک جنین دو سلولی را نام برد که قادر است همه سلولهای بدن یک فرد کامل را بسازد. این سلولها میتوانند به انواع سلولهای جنینی و برون جنینی تمایز پیدا کنند و اندام‌های قابل زیستی را ایجاد نمایند.
ب) پر توان[5]: این نوع سلولها قادر به ساخت غالب یا همه سلولهای فرد هستند. به عنوان مثال سلولهای بنیادی جنینی تحت شرایط خاص میتوانند یک فرد را بسازند ولی قادر به ایجاد سلولهای جفت نیستند. سلولهای بنیادی جنینی و سلولهای پر توان القایی جز این دسته از سلولهای بنیادی میباشند.
پ)چند توان[6]: سلولهای بنیادی هستند كه به تعداد محدودتری از انواع سلول تمایز پیدا می‌کنند (در بافتهای بزرگسال نظیر مغز، مغز استخوان، كبد و… وجود دارند).
ت) یک توان[7]: توانایی ایجاد یک نوع سلول را دارند ولی توانایی خود نوزایی خود را حفظ کردهاند. مانند سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی که توانایی تولید اسپرم را دارند (شکل 1-2) (3).
شکل 1-2: دستهبندی سلولهای بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها (www. njavan.com).
1-1-4 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس منشا
سلولهای بنیادی بر اساس منشا به سه دسته اصلی تقسیمبندی میشوند
1-1-4-1 سلولهای بنیادی جنینی
کشت موفقیت آمیز آزمایشگاهی سلولهای بنیادی جنینی انسانی (ESCs) [8] در سال 1998 توسط تامپسون و همکارانش انجام گرفت.
سلولهای بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی (ICM)[9]جنین در مرحله بلاستوسیت به دست میآیند. بلاستوسیت مرحلهای از تکوین پیش از لانهگزینی در پستانداران است که معمولا چهار تا پنج روز بعد از لقاح ایجاد میشود. در این مرحله جنین 200-100 سلول دارد و به صورت کرهای توخالی است. این کره متشکل از یک لایه سلولی برونی (تروفواکتودرم) است که به طور معمول پس از لانهگزینی در رحم، بخشی از جفت را میسازد. همچنین این کره مجتمعی از سلولها (حدود 30-20سلول) در داخل کره به نام توده سلولی داخلی است که قادرند لایههای مختلف جنین کامل را تولید کنند (شکل 1-3) (4).
شکل 1-3: تصویر شماتیک از سلولهای بنیادی جنینی که توانایی ایجاد سلولهای هر سه لایهی زایندهی جنینی را دارا میباشد و همچنین سلولهای بنیادی بالغ که توانایی خودنوزایی و تمایز را دارند (5) .
1-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف[10]
خون بند ناف غنی از سلولهای بنیادی و سلولهای خونساز است. این سلولها بسیار پرتوان و نامیرا هستند و همچنین در اثر تکثیرهای پی در پی دچار پیری نمی‌شوند، به طوریکه با تزریق و یا جایگزینی آنها در بافت‌‌هایی که آسیب جدی دیده‌اند می‌توانیم به بهبودی و تشکیل سلولهای جدید بافت کمک نمائیم. خون بند ناف دارای 6/0 تا 1 درصد سلولهای پیش‌ساز خونی و بنیادی خونساز است. ژله وارتون بند ناف منبع غنی از موکوپلیساکاریدها بوده که سلولهای بنیادی بالغ نیز در آن یافت میشود (6). خون بند ناف دارای مزایای زیادی چون محدود نبودن به اهداکننده، بلوغ کمتر سلول نسبت به سلولهای فرد بالغ و کاهش احتمال پسزدگی پس از پیوند میباشد (7). همچنین خون بند ناف را میتوان ذخیره نمود و در موارد نیاز برای خود شخص یا فرد دیگری استفاده نمود. استفاده از این سلولها در درمان بیماری‌ها چندان معمول نیست ولی این سلولها در درمان دیابت نوع 1، بیماری‌های قلبی و عروقی، لوپوس اریتماتوس، بیماری‌های نورولوژیک مانند سکته مغزی، پارکینسون و آلزایمر، کم‌خونی‌ها و نقص ایمنی و بیماری‌های کبدی به کار میرود (شکل 1-4) (6).
شکل 1-4: نمایی از بند ناف (رگ‌های بند ناف (2 سرخرگ و یک سیاهرگ) و ژله وارتون[11] و غشا خارجی) (www.mdpi.com).
1-1-4-3 سلولهای بنیادی بزرگسالان (Adult stem cells):
انواع سلول بنیادی بالغ
بسیاری از بافتهای بالغ حاوی سلولهای بنیادی هستند و قدرت تمایز و توانایی خود نوزایی را دارند، به این سلولها سلولهای بنیادی بالغ گفته میشود. در زیر چند مثال از این نوع سلولها آورده شده است:
الف) سلول بنیادی عصبی
سلول بنیادی عصبی، سلول پرتوانی است که:
1) قادر به تکثیر و تولید پیش‌سازهایی است که قابلیت تبدیل به سه نوع اصلی سلولهای سیستم اعصاب مرکزی را دارند: یعنی آستروسیتها، الیگودندروسیت‌ها و نورون‌ها.
2) این سلولها توانایی خودنوزایی را داشته و همچنین به صورت متقارن و نامتقارن تقسیم میگردند.
3) یک سلول بنیادی عصبی خصوصیت پرتوانی خود را تا زمانی طولانی حفظ میکند (8).
فرم در حال بارگذاری ...
